Геномні послідовності більшості вірусів відомі.Зонди нуклеїнової кислоти, які являють собою короткі сегменти ДНК, призначені для гібридизації з комплементарними сегментами вірусної ДНК або РНК.Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) є більш ефективним методом виявлення вірусу.Останнім часом розроблені високопродуктивні методи діагностики.
A. Методика гібридизації нуклеїнових кислот
Гібридизація нуклеїнових кислот, в основному включаючи Саузерн-блот (Southern) і Нозерн-блот (Northern), є новою технікою, що швидко розвивається в галузі діагностики вірусів.Обґрунтування аналізу гібридизації полягає у використанні коротких сегментів ДНК (званих «зондом»), призначених для гібридизації з комплементарними сегментами вірусної ДНК або РНК.За допомогою нагрівання або лужної обробки дволанцюгова цільова ДНК або РНК розділяється на окремі ланцюги, а потім іммобілізується на твердій основі.Після цього зонд додають і гібридизують з цільовою ДНК або РНК.Оскільки зонд мічений ізотопом або нерадіоактивним нуклідом, цільову ДНК або РНК можна виявити за допомогою авторадіографії або за допомогою системи біотин-авідин.Оскільки більшість вірусних геномів було клоновано та секвеновано, їх можна виявити за допомогою вірусоспецифічних послідовностей як зондів у зразку.В даний час методи гібридизації включають: дот-блот, гібридизацію in situ в клітинах, ДНК-блот (ДНК) (Саузерн-блот) і РНК-блот (РНК) (Норзерн-блот).
Технологія B.PCR
Останніми роками було розроблено серію методів ампліфікації нуклеїнових кислот in vitro на основі ПЛР для тестування нечутливих або некультивованих вірусів.ПЛР - це метод, який може синтезувати специфічну послідовність ДНК за допомогою полімеразної реакції in vitro.Процес ПЛР включає термічний цикл із трьох етапів: денатурація, відпал і подовження. При високій температурі (93℃~95℃) дволанцюгова ДНК розділяється на дві одинарні ланцюги ДНК;потім при низькій температурі (37 ℃ ~ 60 ℃) два синтезованих нуклеотидних праймера з’єднуються з комплементарними сегментами ДНК;тоді як при відповідній температурі для ферменту Taq (72 ℃) синтез нових ланцюгів ДНК починається з 3'-кінця праймера з використанням комплементарної ДНК як матриці та окремих нуклеотидів як матеріалів.Отже, після кожного циклу один ланцюг ДНК може бути ампліфікований у два ланцюги.Повторюючи цей процес, кожен ланцюг ДНК, синтезований в одному циклі, може бути використаний як матриця в наступному циклі, і кількість ланцюгів ДНК подвоюється в кожному циклі, що означає, що виробництво ПЛР посилюється зі швидкістю 2n log.Після 25-30 циклів продукція ПЛР ідентифікується за допомогою електрофорезу, і специфічні продукти ДНК можна спостерігати в УФ-світлі (254 нм).Завдяки специфічності, чутливості та зручності ПЛР була прийнята в клінічній діагностиці багатьох вірусних інфекцій, таких як ВГС, ВІЛ, ЦМВ і ВПЛ.Оскільки ПЛР є дуже чутливою, вона може виявити ДНК вірусу на рівні fg, операцію слід проводити дуже обережно, щоб уникнути помилкових позитивних результатів.Крім того, позитивний результат тесту на нуклеїнову кислоту не означає, що в зразку є живий інфекційний вірус.
З широким застосуванням техніки ПЛР розробляються нові техніки та методи на основі техніки ПЛР для різних цілей тестування.Наприклад, кількісна ПЛР у реальному часі може виявити вірусне навантаження;ПЛР in situ використовується для ідентифікації вірусної інфекції в тканинах або клітинах;Вкладена ПЛР може збільшити специфічність ПЛР.Серед них кількісна ПЛР у реальному часі була розроблена більш швидко.Багато нових методів, таких як зонд гідролізу TaqMan, зонд гібридизації та зонд молекулярного маяка, були об’єднані в техніку кількісної ПЛР у реальному часі, яка широко використовується в клінічних дослідженнях.Окрім точного визначення вірусного навантаження в рідині тіла пацієнтів, цей метод також можна використовувати для виявлення стійкого до ліків мутанта.Тому кількісна ПЛР у реальному часі в основному застосовується для оцінки лікувального ефекту та спостереження за переносимістю ліків.
C. Висока продуктивність виявлення вірусних нуклеїнових кислот
Щоб задовольнити потреби у швидкій діагностиці нових інфекційних захворювань, які виникають, були створені різні високопродуктивні методи виявлення, наприклад ДНК-чіпи (ДНК).Для ДНК-чіпів синтезуються спеціальні зонди, які приєднуються до невеликих кремнієвих чіпів у дуже високій щільності, щоб утворити мікрочіп ДНК-зонду (ДНК), який можна гібридизувати зі зразком.Сигнал гібридизації може бути зображений за допомогою конфокального мікроскопа або лазерного сканера та додатково оброблений комп’ютером, щоб отримати величезний набір даних щодо різних генів.Існує два види ДНК-чіпів.«Чіп синтезу» полягає в наступному: специфічні олігонуклеотиди синтезуються безпосередньо на чіпах.Інший — чіп пулу ДНК.Клоновані гени або продукти ПЛР упорядковано надруковані на слайді.Перевагою технології ДНК-чіпів є одночасне виявлення величезної кількості послідовностей ДНК.Остання версія чіпа для виявлення патогенів може ідентифікувати понад 1700 людських вірусів одночасно.Технологія ДНК-чіпів вирішила проблеми традиційних методів гібридизації нуклеїнових кислот і має дуже широке застосування в діагностиці вірусів та епідеміологічних дослідженнях.
Час публікації: 23 грудня 2020 р